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IMAC: Immobilized Metal Affinity Chromatography

IMAC: Immobilized Metal Affinity Chromatography

IMAC: Immobilized Metal Affinity Chromatography

Cromatografía por Afinidad

Una de las principales técnicas empleadas hoy día para la purificación de biomoléculas es la llamada Cromatografía por Afinidad. El principio en el que se fundamentan estas técnicas es el establecimiento, por parte de la biomolécula, de una interacción reversible con un soporte adecuado. Entre dichas técnicas de cromatografía por afinidad, las más conocidas son: avidina – biotina, tinte – ligando (dye – ligand) y mediante metales inmovilizados (IMAC).

Mediante estas técnicas de cromatografía por afinidad ha sido posible la purificación de multitud de enzimas, proteínas y anticuerpos, tales como:

  • inmunoglobulinas;
  • proteínas recombinantes marcadas (con GST o Histidina);
  • proteínas A, G y L;
  • biotina y moléculas biotiniladas;
  • albúmina y macroglobulinas;
  • lectina.

En este post, nos centraremos en la purificación de proteínas recombinantes con marcadores de Histidina (His-tag), mediante Cromatografía de Afinidad de Metales Inmovilizados (IMAC, Immobilized Methal Affinity Chromatography).

Cromatografía de Afinidad de Metales Inmovilizados

Como todo proceso cromatográfico, presenta una serie de pasos para poder llevar a cabo la purificación:

  1. acondicionado del soporte cromatográfico,
  2. inserción de la muestra en condiciones de máxima afinidad,
  3. lavado de los restos presentes en la muestra que no han quedado anclados,
  4. elución del analito de interés bajo unas determinadas condiciones (presencia de un ligando que compita en afinidad con la matriz, cambiando el pH, cambiando la fuerza iónica o cambiando la polaridad).

De este modo logramos obtener la biomolécula de interés pura, además de ofrecer la posibilidad de preconcentrarla.

La primera referencia sobre el empleo de IMAC en la purificación de proteínas data de 1975 (J. Porath y colaboradores, artículo publicado en Nature). En ella se fijaban a un soporte una serie de metales de transición de los cuales era conocida su afinidad por los restos de Histidina y Cisteína presentes en las proteínas. Dicha fijación se llevó a cabo a través de unos ligandos que servían para mantener dichos metales unidos al soporte. Más concretamente, el ligando empleado en este caso fue el ácido iminodiacético (IDA), y el soporte la agarosa.

Desde ese primer trabajo hasta hoy día, el desarrollo de esta técnica ha sido enorme gracias a la aparición de nuevos materiales que han servido como soportes cromatográficos.

Características

Para explicar los distintos tipos de materiales IMAC desarrollados hasta la fecha, nos centraremos en sus tres características más relevantes. Estas serán las causantes de las distintas propiedades y aplicaciones de los mismos.

Metal retenido

Los metales más comúnmente empleados son metales de transición: Co2+, Cu2+y Ni2+. Para algunos casos concretos se han empleado Fe3+ y Zn2+. En función del metal inmovilizado se conseguirá mayor afinidad o mayor especificidad por las proteínas.

Ligando quelante

La influencia del ligando vendrá dada por la fortaleza con que se retiene el ión metálico al soporte. Es por ello que, para uniones más débiles haya mayor probabilidad de que el metal se libere al medio, con el consecuente riesgo de contaminación. Comercialmente existen 3 tipos de ligandos que son combinados con los distintos soportes y metales: IDA (ácido iminodiacético), NTA (ácido nitriloacético) y TED (tri(carboximetil)etilendiamina). Son respectivamente tridentados, tetradentados y pentadentados, es decir, tienen 3, 4 y 5 puntos de unión a los metales (los cuales disponen de número de coordinación 6). Así, lo metales anclados a la matriz mediante TED, serán más difícilmente liberados pero por el contrario dispondrán de menos puntos de unión para interaccionar con la proteína (5 para el ligando, 1 para la proteína).

Matriz

Una vez comentados los ligandos quelantes y los distintos iones metálicos que presentan los materiales IMAC, queda hablar de la matriz. Existen multitud de matrices a las que unir covalentemente el ligando quelante responsable de retener el ión metálico. Entre las más empleadas en productos comerciales están la agarosa y la sefarosa. Además de estas, existen multitud de estudios en los cuales se han empleado otros tipos de soportes como poliacrilato, celulosa y sílica. Todas estas matrices se encuentran disponibles comercialmente y presentan gran variedad de tamaños y presentaciones (partículas esféricas, soportes porosos y no porosos, monolitos y adsorbentes de lecho expandido).

Tiss®-IMAC

De entre los soportes más novedosos que se encuentran en el mercado, destacar las membranas diseñadas por NanoMyP®.  Tiss®-IMAC está constituida por nanofibras poliméricas que ofrecen a estos materiales IMAC una serie de características de gran importancia a la hora de purificar proteínas, como son:

  • alta superficie específica,
  • ausencia de interacciones inespecíficas,
  • resistencia física y química del material
  • y adaptabilidad.

IMAC , Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography

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